Aplicación de PCR real time para la detección de Tritrichomonas foetus y Campylobacter fetus

En un reciente estudio realizado por Laboratorio 9 de Julio se pudo demostrar que la técnica qPCR tiene un 35% más de sensibilidad que el cultivo para la detección de Tritrichomonas foetus en rodeos con fallas reproductivas.

Con la finalidad de brindar más y mejores servicios, Laboratorio 9 de Julio ha implementado desde el año 2017 el diagnóstico por PCR Real Time (qPCR) para Tritrichomonas foetus (T. foetus) y Campylobacter fetus (C. fetus fetus y C. fetus venerealis).

Generalidades

La técnica de la Reacción en la Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que consiste en la generación de millones o miles de millones de copias de una región específica de ADN por la enzima Taq Polimerasa en un tiempo determinado (Figura 1). Sus principales características y ventajas son: sensibilidad, especificidad, rapidez de diagnóstico y sencillez respecto a metodologías laboriosas de aislamiento y cultivo. Para desarrollar el ensayo se debe contar con la información de la secuencia específica de ADN de interés. Comenzó a utilizarse en los 90, se fue especializando y mejorando hasta llegar a los equipos de Real Time que permiten visualizar en tiempo real, la amplificación de la secuencia target.

Figura 1. Amplificación de una secuencia target en miles de millones de copia por actividad de la enzima Taq Polimerasa

En la técnica de PCR convencional, el usuario debe realizar un gel de agarosa para revelar la reacción, usualmente con bromuro de etidio (un intercalante de ADN que fluórese al UV), luego una electroforesis y finalmente visualizar ante luz UV la fluorescencia del Bromuro de Etidio para determinar si hay presencia de banda, significando que hubo amplificación del target (Figura 2).

Figura 2. Bandas de un producto de PCR en gel de agarosa

La diferencia entre Real Time y PCR convencional, es que la PCR Real Time o qPCR, permite detectar en tiempo real la amplificación de ADN generándose curvas que, al finalizar el equipo determina un punto de corte estableciendo un valor de Cycle threshold (Ct – Figura 3) siendo el ciclo en el cual se produce la amplificación del ADN para la temperatura de referencia (Figura 4) de amplificación de cada antígeno, con el cual se puede determinar la presencia o ausencia del target e incluso permite cuantificar la carga bacteriana o viral de la muestra.

Figura 3. Curvas de amplificación, línea en rojo control positivo amplifica en el ciclo 19.

Figura 4. Curvas de amplificación por PCR real Time, temperatura en la que amplifican

En el mercado de Argentina se está adoptando esta metodología con la implementación de trabajos científicos publicados relacionados con el diagnóstico de T. foetus y C. fetus. Anteriormente, solo las instituciones públicas como el INTA, algunos laboratorios de la provincia de Buenos Aires y del interior del país brindaban el servicio de PCR convencional; en el mismo sentido se aplicaba en las universidades para fines de investigación.

Sensibilidad y especificidad

La técnica de cultivo si bien tiene un costo inferior, posee aproximadamente una sensibilidad del 70-72%, que se mejora con los raspajes sucesivos. Asimismo, es importante considerar que la cantidad de protozoos está por debajo del límite de detección por la técnica de microscopía y cultivo, y por ende requiere de un pre-enriquecimiento previo para alcanzar un mayor número de células para ser visualizadas. De acuerdo con las publicaciones, la técnica de qPCR tendría una sensibilidad tal que permitiría detectar hasta 1-2 célula por ml (McMillen et al., 2006, Mukhufhi et al., 2003). En este trabajo de McMillen (2006), se indica que el límite de detección por microscopía y cultivo es de ˃25,000 células por inóculo para el sistema Inpouch, mientras que para qPCR, el límite es de 50 células o hasta 1 célula. Para la técnica de qPCR se ha descripto una especificidad de detección del 98% y una sensibilidad del 90% (Mukhufhi et al., 2003). Mientras que algunos trabajos describen 100% de sensibilidad y 100% de especificidad (Summarell et al., 2018).

Respecto al diagnóstico de Campylobacter fetus, también puede implementarse el diagnóstico por qPCR. Se ha descripto en la literatura que el límite de detección de qPCR es de 1 célula en comparación con las 10-100 células detectadas por PCR convencional. La aplicación de qPCR permite incrementar la sensibilidad 10X respecto otros métodos (McMillen et al., 2006), La especificidad para esta metodología es del 99% y la sensibilidad del 98% (Abril et al., 2007, McMillen., et al., 2006).

Otra posibilidad que nos brinda esta técnica en el diagnóstico de la Campylobacteriosis es la posibilidad de diferenciación entre C. fetus fetus y C. fetus venerealis, tema tan discutido en el ámbito científico, ya que diferentes autores consideran como responsable de la enfermedad solo a C. fetus venerealis. Por otro lado, existe suficiente documentación que C. fetus fetus ha sido aislado de prepucio de toros, mucus de vacas vacías y fetos abortados. La controversia se genera debido a que cepas de C. fetus fetus pueden encontrarse en la materia fecal y llegar a colonizar el prepucio, algunas de las cuales pueden adaptarse al prepucio y otras eliminarse con el barrido de la orina.

Consideraciones sobre las muestras

Debe tenerse especial cuidado con la orina, ya que la urea tiene un posible efecto inhibitorio para qPCR. De igual manera se requieren consideraciones especiales respecto a la higiene de las muestras, aunque el ensayo de qPCR no requiere esterilidad, tampoco se ve afectado por la presencia de sangre y otros contaminantes. Es importante que no transcurran más de 48 hs. luego de la toma de muestra hasta la llegada al laboratorio, realizando el envío de inmediato y en lo posible refrigerando las muestras, en caso contrario las mismas se deben congelar.

En cuanto a la cantidad de raspajes necesarios por qPCR, en la bibliografía está descripto que raspajes sucesivos mejoran la sensibilidad y por lo tanto la detección, a la fecha no hay trabajos científicos que avalen el uso de un solo raspaje para detectar y controlar ambas enfermedades.

Resultados de raspajes prepuciales por cultivo para Tricomonosis versus qPCR

Con la finalidad de comprobar la sensibilidad y especificidad diagnóstica de las pruebas de cultivo respecto a la qPCR se tomaron datos de muestras procesadas en los años 2018, 2019 y 2020 de los cuales se analizaron 178 rodeos con fallas reproductivas y antecedentes de Tricomonosis, en dicho periodo se procesaron 2.779 muestras que fueron inoculadas en medio de cultivo y transporte Plastrige modificado.

El diagnóstico se realizó mediante observación microscópica directa del medio de cultivo y a su vez entre el tercer y cuarto día se tomó una alícuota del cultivo para procesar las muestras mediante qPCR, los resultados son expresados en la tabla 1.

Tabla 1.  Muestras analizadas por cultivo y qPCR en el periodo 2018 al 2020

Para analizar esto datos se utilizó el programa estadístico Winepiscope (http://www.winepi.net/sp/index.htm).

El cultivo demostró una sensibilidad de un 65% y una especificidad del 100% respecto a la qPCR. De las 193 muestras positivas a qPCR solo 126 muestras fueron detectadas por cultivo, en cuanto a la especificidad todas las muestras positivas a cultivo también lo fueron por qPCR. En este estudio la técnica qPCR detectó 67 muestras más positivas, teniendo un 35% más de sensibilidad respecto al cultivo. Del mismo modo se detectaron 13 establecimientos más con qPCR que no se hubieran diagnosticados con el cultivo, demostrando la importancia de aplicar la técnica de qPCR para el diagnóstico de la Tricomonosis.

También se estudió la concordancia entre las pruebas mediante la interpretación del coeficiente kappa, cuanto más próximo esté a 1 mayor el acuerdo que hay entre las pruebas analizadas. Con este dato surge que la concordancia entre cultivo y qPCR es considerable (k= 0,778).

Conclusiones

Los resultados del presente trabajo evidencian una mayor sensibilidad de la técnica de qPCR respecto al cultivo de T. foetus, por lo que implica una detección más eficaz de los toros positivos mejorando   los problemas que conlleva realizar varios raspajes para detectarlos.

En Argentina donde las distancias de los campos son muy amplias con esta metodología se necesitarían realizar menos raspajes para detectar los toros positivos, logrando una importante reducción en los costos operativos. No obstante, no hay evidencia científica que avale el uso de un único raspaje para detectar todos los toros positivos mediante la técnica de qPCR.

Agradecimiento

Por el aporte y asesoramiento para la obtención de los datos estadísticos a:

Dra. Lucía María Campero, Investigadora Asistente-CONICET. JTP, Cátedra de Inmunología Veterinaria Básica Laboratorio de Inmunoparasitología, Dto. de Epizootiología y Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP.